Gonzalez, Jessica Alejandra2025-03-062025-03-062023Gonzalez, Jessica Alejandra. (2023). Bioprospección de enzimas fucoidanasas y su aplicación para la producción de oligosacáridos a partir de fucoidanos de algas pardas de ambientes costeros de la patagonia. Tesis doctoral. Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco.https://rdi-test.unp.edu.ar/handle/123456789/108Los fucoidanos son polisacáridos sulfatados ricos en fucosa constituyentes de la pared celular de las algas pardas. Si bien se ha demostrado que los fucoidanos presentan un amplio espectro de actividades biológicas, su naturaleza heterogénea resulta un obstáculo para su utilización para el desarrollo de agentes terapeúticos. Los fucoidanos nativos, al tener un alto peso molecular, presentan una baja permeabilidad a nivel intestinal y por lo tanto una baja biodisponibilidad. Por el contrario, los productos de bajo peso molecular obtenidos a partir del tratamiento de hidrólisis enzimática con enzimas fucoidanasas (sinónimo fucanasas), permite obtener oligosacáridos sulfatados de estructura más definida, con mayor solubilidad y con bioactividades similares al fucoidano sin digerir, o incluso mayores. El objetivo general de este trabajo fue prospectar enzimas fucoidanasas en una comunidad microbiana de sedimentos Subantárticos, que puedan ser utilizados para la producción fuco-oligosacáridos a partir de fucoidanos de algas pardas de ambientes costeros de la Patagonia. Secuencias homólogas a enzimas de las familias CAZy GH107 (endo-α-1,4-L-fucanasa, endo-α-1,3-L-fucanasa) y GH168 (endo-α-1,4-L-fucanasa) fueron identificadas en un metagenoma de sedimentos intermareales de Bahía Ushuaia, mediante el uso de perfiles ocultos de Markov construídos a partir de alineamientos de la región correspondiente al módulo catalítico de las secuencias depositadas en estas familias. Se identificaron en el metagenoma 7 secuencias relacionadas con la familia GH107 y 22 secuencias con la familia GH168, de las cuales 5 y 18 secuencias se encontraban completas respectivamente. La asignación taxonómica de las secuencias identificadas y sus respectivos scaffolds sugirió que la mayoría de ellas provendrían de organismos pertenecientes al phylum Planctomycetota (80 % relacionadas a enzimas GH107 y 38 % a GH168). Basados en resultados de análisis in silico, fueron seleccionadas cuatro secuencias homólogas a miembros de la familia GH107 para su clonado y posterior expresión en Escherichia coli. Se obtuvo una alta producción de las enzimas en la fracción soluble mediante la expresión a baja temperatura. La actividad enzimática fue estudiada mediante la técnica de C-PAGE, utilizando como sustrato fucoidanos provenientes de ocho especies de algas pardas de la costa patagónica. De las secuencias expresadas, la enzima #113643 (potencialmente proveniente de un miembro del phylum Plactomycetota), de 42 kDa, exhibió una alta actividad catalítica frente a fucoidanos de la especie de alga parda Macrocystis pyrifera. Los productos de degradación fueron observados a partir de los 30 s de incubación a 25 °C, en un amplio rango de temperaturas (5 – 45 °C), salinidades (9,5 – 861 mM NaCl) y pH (4,5 – 9). Los productos de bajo peso molecular resultantes de la catálisis estarían conformados principalmente por una mezcla de oligosacáridos de 3, 6 y 7 unidades de fucosa mono- y disulfatadas. Las características biocatalíticas de la enzima #116343 le otorgan un gran potencial para la obtención de fuco-oligosacáridos, los cuales serán evaluados para la determinación de sus propiedades bioactivas y potenciales aplicaciones biotecnológicas. Por otra parte, los resultados obtenidos en esta Tesis doctoral incrementan nuestro conocimiento sobre la diversidad de microorganismos con potencial para degradar fucoidanos presentes en comunidades microbianas de los sedimentos intermareales de un ambiente Subantártico, particularmente de organismos de difícil cultivo de los que poco se conoce sobre sus capacidades para asimilar fucoidanos.Fucoidans are fucose-rich sulfated polysaccharides that are constituents of the cell wall of brown algae. Although fucoidans have been shown to have a broad spectrum of biological activities, their heterogeneous nature is an obstacle to their use for the development of therapeutic agents. Native fucoidans, having a high molecular weight, have low intestinal permeability and therefore low bioavailability. On the contrary, the low molecular weight products obtained from the enzymatic hydrolysis treatment with fucoidanase enzymes (synonymous fucanases), allow obtaining sulfated oligosaccharides with a more defined structure, with greater solubility and with bioactivities similar to undigested fucoidan, or even higher. The general objective of this work was to prospect for fucoidanase enzymes in a microbial community of Subantarctic sediments, which can be used for the production of fuco-oligosaccharides from fucoidans of brown algae from coastal environments in Patagonia. Homologous sequences to enzymes of the CAZy GH107 (endo-α-1,4-L-fucanase, endo-α-1,3-L-fucanase) and GH168 (endo-α-1,4-L-fucanase) families were identified in a metagenome of intertidal sediments from Bahía Ushuaia, using hidden Markov profiles built from alignments of the region corresponding to the catalytic module of the sequences deposited in these families. Seven sequences related to the GH107 family and 22 sequences related to the GH168 family were identified in the metagenome. Of them, 5 and 18 sequences were complete respectively. The taxonomic assignment of the identified sequences and their respective scaffolds suggested that most of them would come from organisms belonging to the phylum Planctomycetota (80 % related to GH107 enzymes and 38 % to GH168). Based on in silico analysis results, four sequences homologous to members of the GH107 family were selected for cloning and subsequent expression in Escherichia coli. A high production of the enzymes in the soluble fraction was obtained by expression at low temperature. Enzymatic activity was studied using the C-PAGE technique, using fucoidans from eight species of brown algae from the Patagonian coast as substrate. Of the expressed sequences, the 42 kDa enzyme #113643 (potentially from a member of the phylum Plactomycetota) exhibited high catalytic activity against fucoidans from the brown alga species Macrocystis pyrifera. Degradation products were observed after 30 s of incubation at 25 °C, in a wide range of temperatures (5 - 45 °C), salinities (9.5 - 861 mM NaCl) and pH (4.5 - 9). The low molecular weight products resulting from the catalysis would be made up mainly of a mixture of oligosaccharides of 3, 6 and 7 mono- and disulphated fucose units. The biocatalytic characteristics of the #116343 enzyme give it great potential for obtaining fuco-oligosaccharides, which will be evaluated to determine their bioactive properties and potential biotechnological applications. On the other hand, the results obtained in this doctoral thesis increase our knowledge about the diversity of microorganisms with the potential to degrade fucoidans present in microbial communities of intertidal sediments of a Subantarctic environment, particularly organisms that are difficult to culture and little is known about their abilities to assimilate fucoidans.249 p.info:eu-repo/semantics/openAccesshttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ALGAS PARDASECOSISTEMAS MARINOSCOSTAS PATAGONICASTesis de doctorado