Biogeografía de linajes ubicuos y profusos (LUP) de bacterias del Mar Argentino: basado en datos de secuenciación profunda.

Abstract

Las tecnologías independientes de cultivo han producido un punto de quiebre en la microbiología al demostrar que contamos con conocimientos muy rudimentarios sobre la filogenia, metabolismo y ecología de la vasta mayoría de los microorganismos. Gracias a las nuevas tecnologías de secuenciación, contamos actualmente con un nivel de detalle sin precedente de la composición taxonómica de los microbiomas, el cual ha puesto en evidencia que la misma es en extremo compleja. Por ejemplo, se ha demostrado que, como ocurre con los ecosistemas terrestres, las comunidades bacterianas marinas son dominadas por un reducido conjunto de grupos taxonómicos, los cuales son acompañados por una plétora de grupos minoritarios, aunque en extremo diversos. Dada la elevada biomasa y abundancia de las bacterias en el océano, no es difícil vislumbrar que las mismas influyen significativamente en los ciclos biogeoquímicos, regulando su estado y controlando el destino y la magnitud de la reserva de carbono orgánico. Hay que destacar nuevamente que, a pesar de los avances arriba mencionados, estamos en un punto alejado de contar con un conocimiento acabado de la composición, funcionamiento y distribución de las comunidades bacterianas marinas. En el presente trabajo se estudió la composición y distribución de comunidades bacterianas de agua superficial de 17 puntos remotos del Mar Argentino, con el fin de identificar grupos abundantes y ubicuos en nuestros mares, y determinar cuantitativamente si la distribución espacial de los mismos es uniforme (concepto tradicional de que todos los microorganismos están potencialmente en todos lados) o heterogénea. La biogeografía bacteriana es un área poco estudiada en la microbiología tradicional. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que muchos grupos presentan una biogeografía, hecho que ha reactivado el interés de la comunidad científica, con el consecuente florecimiento de varios trabajos en los últimos años. En esta Tesis, se utilizó una base de datos de aproximadamente tres millones de secuencias pareadas del gen de la subunidad ribosomal pequeña (gen 16S) obtenidas mediante secuenciación Illumina de ADN picoplanctónico. Estas secuencias crudas obtenidas (o lecturas) fueron sometidas a un complejo y estricto control de calidad. El mismo implicó un proceso de optimización en el cual se utilizó una “comunidad simulada”, de tamaño reducido y composición conocida. Luego del control de calidad, se obtuvieron 302.597 secuencias de alta calidad de las comunidades del Mar Argentino. La clasificación taxonómica de las mismas permitió determinar que las secuencias más abundantes en nuestros mares corresponden al orden Pelagibacterales (Alphaproteobacteria, Proteobacteria), también conocido como SAR11, y al grupo OM1 (actualmente conocido como Ca. Actinomarina) del phylum Actinobacteria, los cuales en conjunto representaron aproximadamente el 80% de las secuencias. También se identificaron taxa que, aunque menos abundantes que los ya mencionados, exhibieron abundancias sustancialmente mayores que el resto de los grupos detectados. Estos fueron el orden Flavobacterales (o NS5) del phylum Bacteroidetes, el orden Oceanospirillales (o SAR86) de la clase Gammaproteobacteria, y el orden Rhodobacterales (género Amylibacter) de la clase Alphaproteobacteria. Es decir que se identificaron una total 5 taxa abundantes, a los que de aquí en adelante se hace referencia como Linajes Ubicuos y Profusos (LUPs). En conjunto, los LUPs representaron el 86,31% de las secuencias. El resto de las secuencias fueron asignadas a los grupos Marinoscillum, Formosa, NS4, Polibacter, Synechococuss, SAR406, Planctomyces, Fretibacter, PS1, Ascidiaceihabitans, Planktomarina, SAR116, Chesapeake, OM43, Idiomarina, OM60, KI89A, ZD0405 y JTB255. Además, un 11,86% de las secuencias resultaron ser no-clasificables. Para evaluar si los LUPs presentan patrones biogeográficos se estudiaron las correspondientes relaciones taxa-área (TAR), patrones de decaimiento por distancia (DD) y patrones de endemismo, y se realizaron análisis multivariados (NMDS) de cada una de las 17 comunidades de LUPs. Asimismo, se estudió la distribución geográfica de la diversidad de dichas comunidades, la cual se midió mediante índices numéricos de uso común en microecología. Estos estudios se llevaron a cabo a diferentes niveles taxonómicos putativos: especie, género y familia, lo cual se logró agrupando las secuencias en Unidades Taxonómicas Operativas (OTUs) en diferentes niveles de similitud, en base a bibliografía. Además, con el objeto de velar por la consistencia y homogeneidad de la potencia estadística, los estudios fueron repetidos con y sin ecualización. Esto representa un total de: 5 (LUPs) * 3 (niveles taxonómicos putativos) * 2 (ecualizado y no ecualizado) * 14 (TAR, DD con 3 índices, NMDS con 4 índices, endemismo, 5 índices de diversidad) = 420 análisis cuantitativos, los cuales generaron datos originales sobre las comunidades microbianas del Mar Argentino y que además son de relevancia para el conocimiento general de la biogeografía microbiana. Los análisis de las relaciones taxa-área, en general evidenciaron tasas de reemplazo (valor z de la TAR), o turnover, significativos en todos los linajes y con datos ecualizados y sin ecualizar. Dichas tasas fueron similares en los 3 niveles taxonómicos putativos, aunque en general los niveles de agrupamiento menos inclusivos presentaron tasas mayores que los más inclusivos; es decir que los valores más grandes de z se observaron en el nivel putativo de especie y los más pequeños en el de familia. En concordancia con esto, en general también se observaron patrones de DD en todos los índices de similitud utilizados. Es decir que las comunidades cercanas entre sí resultaron ser composicionalmente más parecidas entre ellas que a comunidades ubicadas en puntos geográficos relativamente alejados. Este patrón pudo observarse en la mayor parte los LUPs, niveles de agrupamientos y para datos ecualizados y no ecualizados, aunque para algunos LUPs y combinaciones de parámetros específicas no se observó el decaimiento, o el mismo no fue estadísticamente significativo. Los análisis de endemismo indicaron que cada LUP presenta linajes que son característicos de cada localización geográfica en particular, es decir son endémicas en dicha localización. Se identificaron 69, 78 y 86% de OTUs endémicas en los niveles de similitud de 95, 97 y 99%, respectivamente. Los análisis con secuencias ecualizadas y no ecualizadas fueron similares entre sí. Los ordenamientos realizados mediante NMDS no permitieron evidenciar una relación entre la cercanía en el ordenamiento y la correspondiente cercanía geográfica de manera consistente. Ante estos resultados, se concluye que los ordenamientos mediante NMDS no tienen el poder suficiente para evidenciar por sí solos la existencia de patrones geográficos. El análisis de la distribución espacial de la diversidad mostró que dos de los índices utilizados, ACE y Chao, estuvieron muy relacionados con los esfuerzos de muestreo, o coberturas, logrados para cada LUP en cada muestra. Por lo tanto, los correspondientes resultados no fueron utilizados en los análisis posteriores. El resto de los índices utilizados (índices de diversidad y homogeneidad de Shannon, e índice de Simpson), resultaron ser más robustos. Su análisis indicó que, si bien existieron variaciones en los distintos puntos de muestreos, las mismas no presentaron relaciones consistentes entre muestras con respecto a su distribución geográfica. En su conjunto, los resultados arriba expuestos indican que los LUPs pueden presentar patrones de distribución heterogéneos. Este fenómeno podría obedecer a (i) la ocurrencia de procesos aleatorios, en particular aislamiento por distancia, o a (ii) procesos adaptativos (preferencia de nicho). Es ampliamente conocido que la selección puede causar patrones biogeográficos cuando se relevan ambientes contrastantes (por ejemplo, transectas ecuatorial-polares, transectas trans-cordilleranas, transectas trans-estuariales, columna de agua en el océano y lagos profundos, etc.). Sin embargo, esta segunda explicación es menos plausible que la primera en el caso del presente estudio, ya que las muestras aquí estudiadas corresponden a un mismo ambiente (agua superficial). La deriva ecológica es otro proceso que puede asociarse con la existencia de diferencias composicionales entre comunidades de distintas regiones. Sin embargo, no existe mecanismo conocido por el cual la misma pueda generar patrones de DD, por lo cual no resulta plausible que este tipo de deriva pueda, al menos por sí sola, explicar todos los patrones biogeográficos observados en esta Tesis. Este es el primer estudio en el que se analizó qué linajes del bacterioplancton presentan un mayor aporte a los microbiomas de agua superficial del Mar Argentino. Asimismo, el estudio aporta datos novedosos sobre la existencia de patrones biogeográficos en microbios, tema que, como ya se mencionó, es foco de muchos estudios actuales. En este sentido, se expone la presencia de una estructuración biogeográfica en comunidades de bacterioplancton del Mar argentino, en contraposición al concepto tradicional de que “todo está en todas partes, pero ambiente selecciona”. Si bien es claro que el ambiente siempre impone restricciones en el proceso de ensamblado comunitario, los resultados aquí presentados demuestran que ensambles de LUPs de un mismo ambiente (agua marina superficial) pero de sitios geográficos remotos presentan variaciones composicionales, las cuales como se explicó en el párrafo previo, pueden atribuirse al fenómeno de aislamiento por distancia. Ahora que se descubrió la existencia de estos patrones en el Mar Argentino, será posible diseñar nuevos estudios y experimentos destinados a avanzar en la comprensión de los mecanismos subyacentes.

Culture-independent technologies have produced a turning point in microbiology by demonstrating that we have a very rudimentary knowledge of the phylogeny, metabolism, and ecology of most microorganisms. Thanks to the new sequencing technologies, we currently have an unprecedented level of detail on the taxonomic composition of microbiomes, which has turned out to be more complex that we previously thought. For example, it has been shown that, as occurs with terrestrial ecosystems, marine bacterial communities are dominated by a small set of taxonomic groups, which are accompanied by a plethora of minority but highly diverse groups. Given the high biomass and abundance of marine bacteria, they significantly influence the elements’ biogeochemical cycles, regulating their state and controlling the fate and magnitude of the organic carbon pool. It should be noted once again that, despite the mentioned advances, we are at a point far from having complete knowledge of the composition, functioning, anddistribution of marine bacterial communities. In the present work, the composition and distribution of bacterial communities of surface water from 17 remote points in the Argentine Sea were studied, to identify abundant and ubiquitous groups in our oceans, and quantitatively determine if their spatial distribution is uniform (a traditional concept that all microorganisms are potentially everywhere) or heterogeneous. Bacterial biogeography is an area little studied in traditional microbiology. However, recent studies have shown that many groups present biogeography, a fact that has reactivated the interest of the scientific community, with the consequent flourishing of various works in recent years. In this Thesis, a database of approximately three million paired sequences of the small ribosomal subunit gene (16S gene), obtained by Illumina sequencing of picoplanktonic DNA, was used. The raw sequences obtained (or reads) were initially subjected to complex and strict quality control. The beginning of this work involved an optimization process, which included the use of a "simulated community" to determine the optimal processing parameters of the sample sequences. After quality controls, 387,597 high-quality sequences from the communities of the Argentine Sea were obtained. The analysis of the taxonomic composition allowed the determination that the most abundant sequences in our seas correspond to the order Pelagibacterales (Alphaproteobacteria, Proteobacteria), also known as SAR11, and to the OM1 group (currently known as Ca. Actinomarina) of the phylum Actinobacteria, which in together accounted for approximately 80% of the sequences. A preliminary analysis of the abundances indicated that OM1 was more predominant in regions near the coast, while SAR11 was more prevalent in those further away. Taxa were also identified that, although ess abundant than those already mentioned, exhibited substantially higher abundances than the rest of the detected groups. These were the order Flavobacterales (or NS5) of the phylum Bacteroidetes, the order Oceanospirillales (or SAR86) of the class ammaproteobacteria, and the order Rhodobacterales (genus Amylibacter) of the class Alphaproteobacteria. That is, a total of 5 abundant taxa were identified, which from now on are referred to as Ubiquitous and Profuse Lineages (LUPs). Altogether, LUPs represented 86.31% of the sequences. The rest of the sequences were assigned to the groups Marinoscillum, Formosa, NS4, Polibacter, Synechococcus, SAR406, Planctomyces, Fretibacter, PS1, Ascidiaceihabitans, Planktomarina, SAR116, Chesapeake, OM43, Idiomarina, OM60, KI89A, ZD0405, and JTB255. In addition, 11.86% of the sequences turned out to be unclassified. To assess whether LUPs present biogeographic patterns, the corresponding taxa-area relationships (TAR), patterns of decay by distance (DD), and patterns of endemism were studied, and multivariate analyzes (NMDS) were performed for each of the 17 LUP communities. Likewise, it was evaluated if the diversity of these communities, which was measured by different numerical indices, presents elements compatible with a structured spatial distribution. The studies were carried out at different putative taxonomic levels: species, genus, and family, which was achieved by grouping the sequences into Operative Taxonomic Units (OTUs) at different levels of similarity (99%, 97%, and 95%, respectively), based on the bibliography. In addition, to ensure the consistency and homogeneity of the statistical power, the studies were repeated with and without equalization. This represents a total of 5 (LUPs) * 3 (putative taxonomic levels) * 2 (equalized and non-equalized) * 14 (TAR, DD with 3 indices, NMDS with 4 indices, endemism, 5 diversity indices) = 420 analyses. quantitative, which generated original data on the microbial communities of the Argentine Sea and is also relevant to the general knowledge of microbial biogeography. The analyzes of the taxa-area relationships, in general, showed geographic patterns in all the lineages, and all the grouping levels, and with equalized and non-equalized data, obtaining values of significant replacement rates (z values), and similar in the 3 putative taxonomic levels analyzed. Consistent with this, in general, DD patterns were also found with all the dissimilarity indices studied. In general terms, it was observed that as the distance that separates two communities increases, the dissimilarity becomes greater. In other words, nearby communities are compositionally more like each other than communities that are geographically farther away. This pattern could be observed in most LUPs, cluster levels, and for equalized and non-equalized data, although for some LUPs and specific parameter combinations the patterns could not be detected or were not significant. Endemism analysis indicated that each LUP has lineages that are characteristic of each geographic location, that is, they are endemic to that location. It was found that there were 69, 78, and 86% of endemic OTUs, when similarity levels of 95, 97, and 99% were used, respectively. The analyzes with equalized and non-equalized sequences were like each other. The NMDS analyses were less clear than those performed using the other techniques, since for various sampling points there was no evidence of a relationship between the proximity in the obtained ordering and the orresponding geographic proximity. Given these results, it is concluded that the NMDS rankings do not have enough power to demonstrate by themselves the existence of geographic patterns, at least if they are applied in the way they were applied in this study. The analysis of the spatial distribution of diversity showed that two of the indices used, ACE and Chao, were too related to the sampling efforts achieved for each lineage at each sampling point. Therefore, the corresponding results were not used in subsequent analyses. The rest of the indices (Shannon diversity and homogeneity indices, and Simpson index) turned out to be more robust. Their analysis indicated that, although there were variations between different sampling points, they did not present consistent relationships between samples with respect to their geographic distribution. Taken together, the above results indicate that LUPs may present heterogeneous distribution patterns. This phenomenon could be attributed to (i) the occurrence of random processes, particularly isolation by distance, or to (ii) adaptative processes (niche preference). It is widely known that selection can cause biogeographic patterns when contrasting environments (e.g., equatorial-polar transects, trans-cordilleran transects, trans-estuarial transects, oceanic and deep lakes’ water columns, etc.) are surveyed. However, this second explanation is less plausible than the first one in the case of this study, since the samples studied here correspond to a single environment (surface water). Ecological drift is another process that can be associated with the existence of compositional differences between communities in different regions. However, there is no known mechanism by which it could generate DD patterns, so it is not plausible that this type of drift can, at least by itself, explain the patterns observed in this Thesis. This is the first study in which it was analyzed which bacterioplankton lineages present a greater contribution to the microbiomes of the Argentine Sea. Likewise, the study provides novel data on the existence of biogeographic patterns in microbes, a topic that, as already mentioned, is the focus of many current studies. The presence of a biogeographic structuring in bacterioplankton communities of the Argentine Sea is exposed, which challenges the traditional concept that "everything is everywhere, and the environment selects". Although the environment always imposes restrictions on the community assembly process, the results presented here show that assemblages of LUPs from a single environment (surface marine water) but from remote geographic sites can present compositional variations, which, as explained in last paragraph, can be attributed to the phenomenon of isolation by distance. Now that the existence of geographical patterns in the Argentine Sea have been discovered, it will be possible to design new studies and experiments aimed at advancing the understanding of the underlying mechanisms.