Tesis de posgrado

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En esta colección se depositan todas aquellas producciones obligatorias para finalizar las carreras de posgrado de la Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud como: Tesis de doctorado, Tesis de maestría, Trabajo de especialización.

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Examinando Tesis de posgrado por Autor "Belchior Estevao, Silvia"

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    Estudio de cepas de Corynebacterium pseudotuberculosis, agente etiológico de Linfoadenitis Caseosa, en pequeños rumiantes.
    (Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco. Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud. Departamento de Bioquímica., 2020) Gallardo, Adriana Alicia; Belchior Estevao, Silvia; Paolicchi, Fernando
    Resumen: Corynebacterium pseudotuberculosis, agente etiológico de linfoadenitis caseosa (LC), es un bacilo Gram positivo, pleomórfico con forma de cocobacilo y agrupación en empalizada. Es inmóvil, no esporulado, no capsulado, anaerobio facultativo y desarrolla en medios de cultivos enriquecidos a 37 ºC y pH óptimo 7 a 7,2. La LC es una enfermedad infecto-contagiosa de evolución crónica, que afecta principalmente ovejas, cabras y otros animales domésticos. En equinos y vacunos se manifiesta como linfangitis ulcerativa y en vacas lecheras puede causar mastitis. La LC en ovejas adultas se presenta en forma cutánea y/o visceral. Es considerada una zoonosis ocupacional a nivel mundial. Existen investigaciones y publicaciones sobre la enfermedad tanto en nuestro país como en Canadá, Australia, Francia, Holanda, Nueva Zelanda, Estados Unidos, Brasil, Suiza, Uruguay, Venezuela, Turquía y Cuba entre otros. Los objetivos de esta tesis fueron estudiar las características morfológicas, fisiológicas, metabólicas y de virulencia en aislamientos de C. pseudotuberculosis, de distintas localizaciones geográficas, aislados de lesiones de L C en pequeños rumiantes y determinar si existe relación entre estos aislamientos locales y de otras regiones con alta prevalencia de LC. Se estudiaron 35 aislamientos de C. pseudotuberculosis de distintos orígenes: 7 de caprinos y 28 de ovinos, aislados de distintas lesiones y de diferentes lugares geográficos; 21 aislamientos de Rio Negro, Chubut, Santa Cruz y Tierra del Fuego (Argentina) y 14 aislamientos de los estados de San Pablo: Aracatuba y de Salvador de Bahía (Brasil). Los mismos fueron identificados y confirmados por métodos bioquímicos y moleculares. Por otro lado se determinó la sensibilidad a antibióticos por los métodos de difusión en agar y dilución. Además, se investigó la presencia de integrones que contienen genes de resistencia. Asimismo se estudiaron factores de virulencia, entre ellos: ácidos micólicos, que se determinó mediante cromatografía en capa delgada (TLC) de los ésteres metílicos de ácidos micólicos extraídos de aislamientos de C. pseudotuberculosis; exotoxina (foslipasa D) que es el principal factor de virulencia de este microorganismo y se determinó su acción mediante las pruebas de CAMP y CAMP reversa y mediante la técnica de SDS-PAGE se obtuvo su masa molecular aparente; producción de otras enzimas extracelulares y capacidad de formación de biopelículas, para la cual se utilizó un método colorimétrico con cristal violeta al 0,1 % que permitió categorizar dicha capacidad. Mediante la técnica de microscopia electrónica de barrido, se determinó la interacción de una selección de aislamientos de C. pseudotuberculosis en líneas celulares MDBK (Madin Darb Bovine Kidney) y posteriormente efectos citopáticos sobre las células, utilizando técnicas de coloración de Giemsa y microscopia óptica. Finalmente se aplicaron sistemas de información geográfica (SIG), como herramienta de análisis espacial de aislamientos de C. pseudotuberculosis biovariedad ovis provenientes de distintos sitios geográficos con el fin de encontrar una relación entre los mismos. Los resultados obtenidos mostraron que los aislamientos fueron positivos para la producción de catalasa y ureasa; mostraron reacción variable para -glucosidasa y fosfatasa alcalina y el 100 % fueron negativos para nitratoreductasa, pirazinamidasa, pirrolidonil arilamidasa, -glucuronidasa, - galactosidasa, N-acetil--glucosaminidasa, hidrólisis de esculina y gelatina a 22 °C y a 37 °C. Se determinó que el 100 % de los aislamientos provenientes de la Patagonia Argentina y la región noreste de Brasil, correspondían a la biovariedad ovis. Se registraron biotipos en los aislamientos en relación a la fermentación de los azúcares glucosa, galactosa y maltosa, determinándose que el 33 % de los aislamientos correspondieron al biotipo Glu+Gal-Mal- y el 67 % a Glu+Gal-Mal+. El 33 % de los aislamientos de origen ovino y provenientes de Argentina presento el biotipo Glu+Gal-Mal-. Los restantes aislamientos de Argentina al igual que los procedentes de Brasil fermentaron la maltosa, haciendo referencia al biotipo Glu+Gal-Mal+. Este biotipo se observó en un 70 % en la presentación cutánea, mientras que el biotipo Glu+Gal-Mal- se manifestó en un 60 % en la presentación visceral. Por el método de difusión, amoxicilina-clavulánico, ampicilina, cefotaxima, cefoxitina, ciprofloxacina, cloranfenicol, eritromicina, estreptomicina, gentamicina, imipenem, kanamicina, norfloxacina, penicilina, rifampicina, tetraciclina, trimetroprima–sulfametoxazol y vancomicina fueron activos frente al 100 % de los aislamientos, mientras que amicacina y oxacilina presentaron resultados variables. En los aislamientos que desarrollaron frente a amicacina y oxacilina, se investigó la presencia de integrones de clase 1. El resultado fue negativo, sugiriendo la ausencia del integrón asociado a la resistencia antibiótica. Utilizando el método de dilución, los antibióticos más activos correspondieron a los grupos de cefalosporinas, glucopéptidos, macrólidos, quinolonas y tetraciclinas. Se demostró menor actividad de β-lactámicos y aminoglucósidos. No se registró variabilidad en los perfiles antibióticos en los aislamientos procedentes de diferentes fuentes. De acuerdo a los frentes de corrida (Rf) obtenidos, C. pseudotuberculosis biovariedad ovis presentó los ácidos micólicos AM tipo IV, V y VI. Los aislamientos de Argentina y de Brasil mostraron el mismo perfil de ácidos micólicos. Las pruebas de CAMP y CAMP reversa resultaron positivas poniendo en evidencia la acción de la exotoxina. La masa molecular aparente de la misma se estimó en 29,55 kDa. Se registró un 100 % de actividad hemolítica en sangre de oveja, confirmando la producción de fosfolipasa D. El 3 % de los aislamientos no presentaron hemólisis sobre eritrocitos humanos y ninguno tuvo acción sobre eritrocitos de equino, este resultado podría deberse a la composición fosfolípidica especifica de la membrana eritrocitaria de cada especie de mamífero. Los aislamientos exhibieron el siguiente perfil enzimático: el 100 % mostró positiva la producción de catalasa, ureasa, carboxilesterasa, amilasa, hemolisina en sangre de carnero y actividad proteolítica. El 48 % y el 97 % de los aislamientos exhibieron positiva la producción de caseinasa y hemolisina en sangre humana, respectivamente. El 100 % de los aislamientos mostró negativa la producción de lecitinasa, lipasa verdadera, fenilalanina deaminasa, hemolisina en sangre de caballo y gelatinasa a 4 °C y 37 °C. Los resultados de los diferentes ensayos confirmaron la producción de la fosfolipasa y otras enzimas y sugieren el papel de estos factores de virulencia sobre los efectos citopáticos que se observaron en los cultivos celulares durante un período de 72 h. Se demostró la capacidad de adherencia a las 6, 24 y 72 h post infección; y se observó que las bacterias provocaron los siguientes efectos citopáticos sobre las células MDBK: lisis celular, vacuolas citoplasmáticas y alteración de la relación núcleo/citoplasma. Los resultados de lisis celular fueron analizados estadísticamente. No se encontraron diferencias significativas para las 6 h post infección del cultivo, mientras que si existieron diferencias significativas a partir de las 24 h, observándose 100 % de lisis celular en el 50 % de los aislamientos estudiados. Respecto de la vacuolización citoplasmática el análisis estadístico en este caso reveló diferencias significativas desde las 6 h de iniciada la infección. El 50 % de los aislamientos provocó la vacuolización citoplasmática en más del 60 % de la monocapa celular a las 72 h postinfección. Para el análisis de la alteración en la relación núcleo/citoplasma se observaron diferencias significativas entre los distintos aislamientos a diferentes tiempos de infección. El 50 % provocaron la alteración en la relación núcleo/citoplasma en más del 40 % de la monocapa celular a las 24 h postinfección. Todos los aislamientos de C. pseudotuberculosis mostraron la capacidad de producir biopelículas y el mayor porcentaje correspondió a productores moderados (47 %). Entre los aislamientos de Argentina predominaron tanto los productores débiles (36 %) como los moderados (36 %) mientras que en Brasil el 75 % de los aislamientos mostraron capacidad de producción de biopelículas moderada y no se detectaron productores fuertes. La aplicación de SIG permitió el abordaje de los resultados desde una visión interdisciplinaria. La distribución dispersa de los aislamientos condujo a realizar el análisis de los mismos considerando la variable clima. Este estudio, permitió encontrar una relación entre los aislamientos provenientes de provincias de la Patagonia Argentina y estados de Brasil. Surgieron dos grupos bien diferenciados, el 74 % tuvo una relación directa con el clima seco por otra parte el 26 % de los aislamientos se ubicó en zonas asociadas a la clasificación de clima lluvioso y templado A partir de estos resultados se concluye que: -Existe una amplia variabilidad fenotípica entre los aislamientos de C. pseudotuberculosis y presentan capacidades diferenciales en su metabolismo, sensibilidad antibiótica, grados de intensidad del daño celular y de formación de biopelículas. Conocer estas características permitió establecer aspectos diferenciales y hallar una vinculación climática-estacional con respecto a su presentación endémica en las regiones de procedencia de los aislamientos investigados. -Los aislamientos de C. pseudotuberculosis provenientes de ambos países corresponden a la biovariedad ovis. Entre los aislamientos de Argentina y Brasil existen variantes bioquímicas para la producción de enzimas α-glucosidasa y fostafatasa alcalina y en la fermentación de la maltosa. Se destacan 2 biotipos, Glu+ Gal- Malt- y Glu+ Gal- Malt+. Siendo este último más frecuente en la presentación cutánea y el primero en ambas formas, cutánea y visceral. -El 100 % de los aislamientos corresponden a C. pseudotuberculosis biovariedad ovis confirmados mediante la secuenciación del gen que codifica para el 16S ARNr, con un muy alto grado de similitud frente a cepas de referencia depositadas en bancos genéticos. -Una amplia gama de antibióticos utilizados en salud pública y/o veterinaria, ensayados por el método de difusión en agar, in vitro, resultan eficaces frente a C. pseudotuberculosis biovariedad ovis. Existen entre los aislamientos resultados variables frente a amicacina y oxacilina. Los aislamientos con y sin desarrollo frente a amicacina provienen tanto de la región patagónica Argentina como de los estados de Brasil. -En este estudio, no se detectaron integrones clase 1 en los aislamientos de C. pseudotuberculosis biovariedad ovis que desarrollaron frente a aminoglucósidos; por lo tanto es posible que el mecanismo de resistencia este dado por otros elementos genéticos. -En el método de dilución (CIM) in vitro, se demuestra una alta sensibilidad de C. pseudotuberculosis biovariedad ovis frente a diferentes grupos de antibióticos, pero también menor actividad de β-lactámicos y aminoglucósidos. -Los aislamientos de C. pseudotuberculosis biovariedad ovis procedentes de diferentes fuentes no registran variabilidad en los perfiles antibióticos. -A pesar de las diferencias de localización geográfica, sitio de lesión y especie animal, los aislamientos de C. pseudotuberculosis biovariedad ovis de Argentina y de Brasil muestran el mismo perfil de ácidos micólicos: tipo IV, V y VI, que corresponden a cetomicolatos, epoximicolatos y micolatos dicarboxilicos, respectivamente. -El 100 % de los aislamientos de C. pseudotuberculosis biovariedad ovis presentan la fosfolipasa D, confirmada por técnica de PCR (gen pld) y revelada en el laboratorio a través de las pruebas bioquímicas de CAMP y CAMP reversa. Ambas pruebas fueron claves para la identificación de C. pseudotuberculosis, dado que permitieron la expresión del principal factor de virulencia de este microorganismo. -C. pseudotuberculosis biovariedad ovis es capaz de adherirse e invadir líneas celulares no fagocíticas, permaneciendo viable hasta 72 h, induciendo diferentes grados de intensidad en los efectos citopáticos estudiados. -Los aislamientos de C. pseudotuberculosis biovar ovis, estudiados en este trabajo, demuestran virulencia debido a la producción de algunas enzimas (catalasa, caseínasa, carboxilesterasa, amilasa, ureasa, hemolisina), capacidad de adherencia e internalización en líneas celulares no fagocíticas con producción de ECP y formación de biopelículas. -El análisis a través de SIG resulta útil para identificar como variable al clima permitiendo establecer un vínculo climático-estacional entre aislamientos de C. pseudotuberculosis biovar ovis provenientes de zonas endémicas de LC de Argentina y de Brasil.